撰文：肿瘤代谢挖掘工肿瘤代谢领域系列文献精精读期期刊：NatureMetabolism标题：NRF2activationpromotestherecurrenceofdormanttumourcellsthroughregulationofredoxandnucleotidemetabolism作者：JamesV.Alvarez（杜克大学）时间：.04.20研究亮点1.本文结合代谢组学和转录组学，通过比较乳腺癌中癌基因Her2存在和抑制情况下细胞代谢组和转录组的变化，系统性地探讨了肿瘤细胞代谢如何响应癌基因抑制的变化，并阐明了代谢重编程在复发性肿瘤中的调控机制与功能。2.研究结果揭示了肿瘤细胞适应治疗引起的代谢应激的重要作用，并通过代谢重编程来确定NRF2通过调节氧化还原和核苷酸代谢促进休眠肿瘤细胞的复发的新功能。3.为了确定NRF2下游潜在的靶向途径，本文通过在体CRISPR筛选，以确定对复发性肿瘤生长最关键的NRF2调控途径。发现抑制谷氨酰胺酶（抑制剂CB-）能够阻止休眠肿瘤细胞复发，为联合Her2抑制剂治疗复发性乳腺肿瘤提供了新的治疗方法。关键技术和方法：代谢组学、转录组学、在体CRISPR筛选研究背景代谢重编程是肿瘤转化的早期事件，代谢变化在一定程度上是通过癌基因和抑癌基因直接调节代谢途径介导。比如，在乳腺癌中，Her2/neu信号除了通过PI3K-Akt途径调节葡萄糖代谢外，还通过调节脂肪酸合成和脂质储存途径促进脂肪酸的从头合成（图1）。图1.癌基因和抑癌基因调控细胞代谢重编程[1]肿瘤休眠最早是在临床上观察到的一种缓慢或停滞生长的原发性或转移性肿瘤的临床现象。肿瘤切除后复发的现象最早可追溯到古罗马，当医生Celsus(公元前25年至公元50年)注意到某些类型的癌症复发时，他描述为“切除后，即使伤疤形成，疾病又已经恢复，并导致死亡。”直到年Hadfield使用了“休眠”一词用来描述长期存活而又未见明显增殖的恶性肿瘤细胞，这些肿瘤通常被认为是复发性疾病的罪魁祸首。在休眠阶段，肿瘤不会表现出体积的增大，并且可以又肿瘤的大量休眠或细胞休眠引起。当肿瘤细胞增殖和细胞死亡之间存在平衡是，肿瘤大量休眠就会出现，而这种平衡通常是由免疫系统休眠或血管生成不足介导的。细胞休眠通常由治疗干预及肿瘤转移造成的缓慢增长或不增殖的状态（图2）。图2.肿瘤休眠的生物学机制[2]然而，与大量报道的关于快速增殖肿瘤细胞代谢的研究相比，对肿瘤或缓慢增殖肿瘤细胞的代谢特性知之甚少。同样的，对于休眠的肿瘤细胞重新进入细胞周期或重新开始快速增殖时形成的复发性肿瘤的代谢重编程过程也鲜有报道。鉴于癌细胞增殖与代谢之间的密切关系，本文作者推测在增殖与休眠之间的转换过程中，癌细胞的代谢极有可能发生了显著变化。肿瘤细胞在治疗后存活并最终产生抵抗力，必须适应治疗引起的代谢应激，然而，尚不清楚特定代谢途径的持续活化是否在调节肿瘤休眠和复发中起着关键作用及其调控的分子机制。为了深入了解抑制癌基因后肿瘤细胞代谢的变化，以及这些变化是如何促进治疗后残存细胞的存活和复发的，本文作者运用了人表皮生长因子受体-2（Her2）驱动的乳腺癌转基因小鼠模型。在该模型中，强力霉素（DOX）可诱导双转基因MMTV-rtTA/TetO-Her2（MTB/TAN）小鼠表达Her2，并促进侵袭性乳腺癌的形成；去除DOX可下调Her2并导致肿瘤消退。然而，本文作者在“Par-4DownregulationPromotesBreastCancerRecurrencebyPreventingMultinucleationfollowingTargetedTherapy”（于年发表在CancerCell上，图3）一文中发现，在乳腺癌中，一小部分肿瘤细胞在形成复发性肿瘤前一直处于休眠状态。利用这个模型，研究者们探究了伴随Her2下调中肿瘤细胞休眠和肿瘤复发的代谢变化。图3.Par-4下调在肿瘤复发中的作用[3]研究结果解析1.乳腺癌细胞中，Her2下调导致代谢改变和氧化还原稳态失调为了研究Her2下调对代谢的影响，本文作者使用了Her2驱动的乳腺癌转基因（MMTV-rtTA/TetO-Her2）小鼠模型，在这一模型中肿瘤细胞保持了对Her2的依赖性。研究者们将得到由DOX诱导产生的原发性肿瘤消化后，在无血清的非贴壁的条件下培养形成乳腺癌肿瘤小球（图4a）。通过对肿瘤小球中细胞增殖标志物（Ki67，绿色）和细胞凋亡标志物（CC3，红色）染色发现，撤除DOX诱导2天后，Her2的下调能够明显下调细胞的增殖能力（图4b）；7天后，细胞发生大量的凋亡（图4c）；然而13天后，细胞既不增值也不发生凋亡，处于一种静止的状态（图4d）。紧接着，研究人员通过回补DOX发现，这些幸存的细胞仍具有增殖能力（图4e）。上述结果表明，一部分乳腺癌细胞在Her2下调的状态下能够存活，并保持一种非增殖的休眠状态。接下来，研究人员将运用这个模型并结合非靶向代谢组学来描绘Her2下调后细胞代谢变化情况。为了避免凋亡细胞对代谢组学的检测造成影响，研究人员选取了撤除DOX诱导的第四天（即在失去Her2信号后，但在细胞凋亡开始前）作为研究对象（图4f）。在种可测量的代谢物中，70种显著增加，26种显著减弱（图4g）。葡萄糖和丙酮酸水平在Her2下调后下降，而乳酸水平升高（图4h）。一些柠檬酸循环中间产物含量增加，包括柠檬酸盐/异柠檬酸盐、顺乌头酸盐和α-酮戊二酸盐（图4i）。此外，Her2下调导致多种酰基肉碱含量增加，这表明Her2下调促进细胞脂肪酸氧化（FAO）的代谢能力（图4j）。谷胱甘肽是细胞内一种重要的抗氧化剂，它通过NAPDH的还原能力保持其还原状态。在多种肿瘤细胞中均发现GSH水平升高。令人惊喜的是，Her2的下调也调控了谷胱甘肽代谢组分稳态，谷胱甘肽的还原形式（GSH）和氧化形势（GSSG）之间的比率显著降低（图4k），这与NADP+的增加（图4l）和NADPH的降低（图4m）一致。综上所述，以上结果表明Her2下调可诱导细胞利用FAO获取能量，并导致氧化还原状态的失调。图4.Her2下调引起代谢变化2.抑制Her2增强细胞活性氧（ROS）水平，导致活性氧依赖性细胞的死亡谷胱甘肽和NADP的氧化还原状态的变化往往是由ROS积累引起的氧化应激反应。因此，研究人员用荧光素（DCFDA）直接测定了撤除DOX诱导4天后肿瘤小球中ROS的含量，结果表明Her2的下调导致ROS水平显著升高（图5a）。此外，用Her2/EGFR双分子抑制剂lapatinib治疗高表达Her2的人乳腺癌细胞株BT和SKBR3后，两株细胞系中ROS水平均有剂量依赖性的增加（图5b,c）。鉴于ROS在诱导细胞死亡中的作用，研究人员接下来进一步探讨了氧化应激增加是否有助于Her2抑制后的细胞死亡。使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）治疗和外源GSH处理细胞可防止ROS积累（图5d），并在lapatinib治疗后挽救细胞活力（图5e,f）。上文提到，Her2下调可诱导细胞利用FAO获取能量。故，研究人员用FAO抑制剂etomoxir处理细胞发现，抑制FAO可以组织Her2下调后ROS的积累（图5g），并部分挽救了细胞活力（图5h）。上述结果表明，Her2抑制后FAO的诱导是ROS积累的主要原因。图5.抑制Her2增加ROS水平，导致ROS依赖性的细胞死亡3.NRF2抗氧化转录活性在休眠和复发肿瘤中被激活Her2抑制导致ROS依赖性细胞死亡的发现表明，休眠的肿瘤细胞能够存活下来可能是激活了细胞抗氧化途径。转录因子NRF2是细胞适应性抗氧化的关键调节因子，其已被证实是肿瘤进展、抗治疗和转移的驱动因素。研究人员首先在体内评估了在Her2下调后NRF2蛋白是否变得稳定。在患有原发性肿瘤的MTB/TAN小鼠或撤除DOX不久后的肿瘤样本中发现，Her2下调后NRF2的蛋白水平明显升高（图6a）。NRF2在原发性肿瘤中低表达，但在Her2下调后稳定并位于肿瘤细胞的细胞核中（图6b）。这些结果表明Her下调使得ROS水平增加，从而导致NRF2在体内的稳定。在肿瘤复发过程中，一小部分肿瘤细胞在复发前存活下来并保持休眠状态。研究人员进一步确定了NRF2在休眠细胞中表达是否仍然升高。值得注意的是，对休眠肿瘤中NRF2的免疫荧光染色显示，休眠细胞细胞核中NRF2染色上调，这表明这种抗氧化反应持续存在于休眠肿瘤中（图6c,d），且大多数复发性肿瘤比原发性肿瘤要高表达NRF2（图6e,f）。综上所述，休眠期和复发性肿瘤通过上调NRF2抗氧化途径以应对Her2下调引起的代谢变化。图6.NRF2抗氧化转录活性在休眠和复发肿瘤中被激活4.NRF2促进肿瘤复发研究人员通过在原发性肿瘤中外源过表达活性形式的NRF2（caNRF2，缺乏结合其负性调节因子KEAP1的N端结构域）试图确定NRF2是否促进肿瘤复发（图7a,b）。在MTB/TAN小鼠的乳腺中原位注射表达对照在体或caNRF2的原代肿瘤细胞。在原发性肿瘤形成后，小鼠撤除DOX诱导Her2下调和肿瘤消退。对照组和caNRF2组在撤除DOX后均完全消退（肿瘤体积减少95%以上）。每周观察仍有残留肿瘤的小鼠以检测肿瘤复发的程度（图7c）。结果表明，表达caNRF2组比对照组肿瘤复发快3周（图7d），提示我们NRF2能够在体促进肿瘤复发。那么，NRF2的表达是否于乳腺癌患者的不良临床预后相关呢？研究人员通过数据库对名乳腺癌患者中NRF2下游基因分析发现，高活性NRF2与复发风险呈正相关（图7e,f）。接下来研究人员想确定是否有直接证据证明NRF2激活在人类复发性乳腺癌中。通过分析一项快速尸检研究的RNA测序数据，该研究收集了匹配的原发性和转移性复发肿瘤，发现NRF2核心基因特征在复发性肿瘤中显著富集（图7g）。基因富集分析显示，8例复发性肿瘤的NRF2核心特征明显上调（53.3%），6例（40%）无明显变化，仅1例（6.7%）显著下降（图7h）。上述结果提示原发性肿瘤中高NRF2活性可能促进乳腺癌的复发。图7.NRF2促进肿瘤复发5.NRF2调控复发性肿瘤的代谢重编程为了探究NRF2对复发性肿瘤中代谢途径的调控作用，研究人员对NRF2野生型和敲除的复发性肿瘤细胞及DOX诱导Her2表达的原发性肿瘤细胞进行了代谢组学研究。通过组学数据分析发现，敲除NRF2的复发性肿瘤细胞中谷胱甘肽代谢途径发生了显著改变（图8a）。此外，在原发性肿瘤细胞中给，随着Her2的下调，GSH:GSSG水平降低，且复发肿瘤细胞的GSH:GSSG比率是原发肿瘤细胞的四倍多，复发性肿瘤细胞中的敲除NRF2使GSH:GSSG比率恢复到比原代细胞水平还低（图8b）。研究人员进一步发现，复发性肿瘤细胞中敲除NRF2导致参与从头合成谷胱甘肽的酶的表达大幅度减少，包括谷氨酸半胱氨酸连接酶Gclm和半胱氨酸转运体Slc7a11（图8c）。DCFDA染色显示NRF2敲除细胞中ROS水平增加了两倍（图8d）。综上所述，这些结果表明Her2信号调节原代细胞的氧化还原稳态，而NRF2维持复发肿瘤细胞的氧化还原稳态（图8e）。根据图8a中代谢途径的富集分析发现，敲除NRF2的复发性肿瘤细胞中嘌呤和嘧啶核苷酸代谢途径也发生了显著的变化。研究人员通过进一步验证发现，高表达NRF2的复发性肿瘤细胞中嘌呤和嘧啶核苷酸水平升高，这表明NRF2在复发性肿瘤细胞中驱动核苷酸的合成（图8f,g）。磷酸戊糖途径（PPP）对核苷酸的从头合成至关重要。进一步研究发现，敲除NRF2后，PPP氧化酶Pgd表达下调（图8h），且PPP中多数代谢中间产物减少（图8i）。总之，这些发现表明NRF2活性在复发性肿瘤中是必需的，既可以维持氧化还原内稳态，也可以驱动促进肿瘤生长的合成代谢途径（图8j）。图8.NRF2调控复发性肿瘤的代谢重编程6.CRISPR在体筛选NRF2调控肿瘤复发的关键信号通路上述发现表明，NRF2参与调控复发性肿瘤中的氧化还原和核苷酸代谢。此外，已有研究报道，NRF2也能调控解毒基因的表达。为了进一步探究NRF2调控肿瘤复发的关键信号通路，本文作者对靶向参与氧化还原、解毒和核苷酸合成的关键基因的sgRNA基因库进行了在体的CRISPR/Cas9筛选（图9a）。通过分析差异基因发现，调节氧化还原状态的硫氧还原蛋白酶Txn1、Txn2和Txnrd1，及参与PPP途径的Pgd和Ppat蛋白对肿瘤复发起着关键作用（图9a,b）。这些结果表明，NRF2通过硫氧还原蛋白还原酶调节休眠细胞内的氧化还原稳态，以及通过PPP途径调节核苷酸生物合成。那么，复发性肿瘤细胞对NRF2活性的依赖是否会导致代谢脆弱性，而代谢脆弱性可能是预防肿瘤复发的靶点。已有研究表明，在非小细胞肺癌模型中，有KEAP1缺失导致的NRF2激活对谷氨酰胺酶抑制剂敏感。确实，在乳腺癌复发模型中，谷氨酰胺酶抑制剂CB-和BPTES能够显著抑制复发性肿瘤细胞生长，且这一作用依赖于NRF2（图9d,e）。那么抑制谷氨酰胺酶是否可以阻止休眠肿瘤细胞再激活？研究人员将原发性肿瘤细胞原位注射至MTB/TAN小鼠乳腺中，DOX诱导肿瘤生成，撤除DOX后获取残留的休眠细胞，并在存在血清和生长因子的情况下，添加或不添加CB-检测细胞的增殖能力（图9f）。结果表明，在不添加CB-情况下，10%的休眠细胞可以增殖形成集落；在添加CB-情况下，集落形成效率降低近四倍（图9g,h）。综上所述，谷氨酰胺酶抑制剂CB-可以在体外有效地阻止休眠肿瘤细胞的再此激活。图9.CRISPR在体筛选NRF2调控肿瘤复发的关键信号通路文章总结治疗后休眠肿瘤细胞的存活和复发是癌症患者死亡的主要原因。这些细胞的代谢特性可能与快速生长的肿瘤的代谢特性不同。本文作者揭示了在乳腺癌细胞中下调Her2能够调控细胞代谢的变化，最终导致氧化应激和抗氧化转录因子NRF2的补偿性上调。NRF2在动物模型和预后不良的乳腺癌患者的休眠期和复发性肿瘤中被激活。NRF2的组成型激活加速了肿瘤复发。在复发性肿瘤中，NRF2信号传导诱导转录代谢重编程以重建氧化还原稳态并上调从头核苷酸合成。NRF2驱动的代谢状态使复发的肿瘤细胞对谷氨酰胺酶抑制敏感，这阻止了体外休眠肿瘤细胞的再激活。本文揭示了NRF2驱动的代谢重编程促进休眠乳腺癌复发的功能与分子机制，为靶向乳腺癌复发提供了潜在的靶点。论文链接：